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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9基因编辑系统工具
——crRNA、sgRNA化学定制合成,商品化重组Cas9核酸酶、重组dCas9蛋白

 
北京泽平代理的进口IDT(Integrated DNA Technologies)Alt-R™ CRISPR-Cas9基因编辑系统,提供免费序列设计工具,提供化学合成CRISPR-Cas9中crRNA(CRISPR-derived RNA)、sgRNA(small guide RNA)的定制合成服务,并生产商品化通用型tracrRNA(trans-activating crRNA)、化脓性链球菌S. pyogene来源并由E.coli大肠杆菌表达的高保真或荧光修饰重组Cas9核酸酶(Cas9 nuclease,限制性内切酶,基因组DNA双链剪切)、重组Cas9切口酶(Cas9 nickase,即缺口酶,对靶链、或非靶链进行DNA单链剪切)、重组dCas9蛋白(无剪切功能,靶点占位蛋白,用于CRISPRi)、以及增强RNP(ribonucleoprotein,核糖核蛋白复合体)电转染效率的电穿孔增强剂、增强HDR(Homology directed repair,同源重组修复)概率的HDR增强剂HDR供体DNA的化学合成服务,提供从设计到多重基因组编辑、CRISPR干扰等试剂的工具平台。




 


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IDT Alt-R CRISPR-Cas9系统crRNAtracrRNAsgRNACas9核酸酶Cas9切口酶dCas9蛋白电穿孔增强剂HDR增强剂HDR DNA供体
IDT Alt-R CRISPR-Cas12a/Cpf1系统

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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9概述

IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas9系统,分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰,对化脓性链球菌S. pyogene Cas9内切酶结构域进行突变,获得了高精确性的单链、双链剪切功能,再通过电穿孔(如Lonza Nucleofector核转染系统)转染RNP,可进行精确地基因编辑操作。

传统构建CRISPR-Cas9质粒的方法,质粒大小高达6-10kb,很难转染,而如使用原代细胞等难转染的细胞,转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas9,使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法,通过优化CRISPR-Cas9组件,在提升剪切精确性的基础上,提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶率,进而提高了基因编辑效率



 

 

 


IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9产品

1、Cas9核酸酶

Alt-R™ Cas9核酸酶,S. pyogene来源Cas9,大肠杆菌表达纯化,添加NLS(Nuclear localization sequence,NLS)和C端6-His标签。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

货号 产品名称 规格 备注
1081058 Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 µg 100 µg 野生型,10 µg/µL,100 µg = 610 pmol.
1081059 Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 500 µg 500 µg
10000735 Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 5 mg 5 mg


 
Alt-R™ HiFi Cas9高保真核酸酶,经序列优化,显著提高中靶率,是常规实验的更佳选择,非常适合棘手的基因组编辑应用。

货号 产品名称 规格 备注
1081060 Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg 100 µg 高保真,10 µg/µL,100 µg = 610 pmol
1081061 Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 500 µg 500 µg
10007803 Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 5 mg 5 mg

 


Alt-R™ Cas9-GFP核酸酶、Alt-R™ Cas9-RFP核酸酶,具有NLS和C端6-His标签。添加GFP绿色荧光、或RFP红色荧光修饰,专为需要蛋白质转染后可视化、或使用荧光激活细胞分选 (FACS) 富集编辑细胞的应用设计。

货号 产品名称 规格 备注
10008100 Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 100 µg 100 µg GFP标签,10 µg/µL,100 µg = 530 pmol.
10008161 Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 500 µg 500 µg
10008162 Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 100 µg 100 µg RFP标签,10 µg/µL,100 µg = 530 pmol.
10008163 Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 500 µg 500 µg


 
Alt-R™ Cas9核酸酶(不含甘油),具有NLS和C端6-His标签。以10µg/µL的无甘油溶液形式提供。

货号 产品名称 规格 备注
10007806 Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 100µg 100 µg 无甘油,10 µg/µL,100 µg = 610 pmol
10007807 Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 500µg 500 µg
10007808 Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 5mg 5 mg


 

 

2、Cas9切口酶

Alt-R™ Cas9切口酶/缺口酶,S. pyogene来源Cas9,大肠杆菌表达纯化,添加NLS和C端6-His标签。其中Alt-R™ Cas9 D10A切口酶中RuvC-like内切酶结构域功能失活,对DNA靶向链进行单链切割。Alt-R™ Cas9 H840A切口酶,HNH结构域失活,对非靶向链单链切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

货号 产品名称 规格 备注
1081062 Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 100 µg 100 µg 缺口酶,切割靶向链(不包含PAM的链)
1081063 Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 500 µg 500 µg
1081064 Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 100 µg 100 µg 缺口酶,切割非靶向链(包含PAM的链)
1081065 Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 500 µg 500 µg


 

 

3、dCas9蛋白

Alt-R™ dCas9占位蛋白,S. pyogene来源Cas9,大肠杆菌表达纯化,丧失内切酶功能,添加NLS和C端6-His标签。dCas9蛋白可用于CRISPRi,进行基因下调(knockdown)等,相比RNAi,由于CRISPRi需要在转录起始位点附近才能发挥功能,其脱靶率远低于RNAi。Alt-R™ dCas9蛋白,以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

货号 产品名称 规格 备注
1081066 Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3, 100 µg 100 µg 无切割活性
1081067 Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3,500 µg 500 µg


 

 

4、crRNA(定制)

Alt-R™ crRNA,由19-20nt特异性序列(定制)和16nt通用序列融合形成,相比野生型,序列更短,中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解,必须与tracrRNA一起使用以形成gRNA。

Alt-R™ crRNA XT,相比Alt-R™ crRNA,经其他化学修饰,用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验,可提高基因编辑的稳定性。必须与tracrRNA一起使用。

货号 产品名称 规格 备注
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol 2 nmol 36nt,带Alt-R修饰,与tracrRNA结合使用
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol 10 nmol
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 50 nmol 50 nmol
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 100 nmol 100 nmol
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol 2 nmol 36nt,比crRNA多了额外化学修饰,更稳定
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol 10 nmol


 

 

5、sgRNA(定制)

Alt-R™ sgRNA,由crRNA和tracrRNA序列融合组成的单个RNA,含有19-20nt的特异性序列(定制)和80nt通用序列,经化学修饰,稳定性更高,用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验。相比体外转录的sgRNA,减少细胞免疫反应,更小细胞毒性。

货号 产品名称 规格 备注
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol 2 nmol 100nt,两端有2’OMe 碱基和硫代磷酸酯PS修饰
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol 10 nmol
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 50 nmol 50 nmol
定制 Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 100 nmol 100nmol


 

 

6、tracrRNA

Alt-R™ tracrRNA,通用67nt序列,远远短于野生型的89nt,缩短后性能提高,经化学修饰,具有核酸酶抗性。可提供荧光标记,测定转染效率。必须与crRNA一起使用以形成gRNA。

货号 产品名称 规格 备注
1072532 Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol 5 nmol 67nt,与crRNA结合使用
1072533 Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol 20 nmol
1072534 Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 100 nmol 100 nmol
1075927 Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 5 nmol 5 nmol 67nt,带ATTO荧光
1075928 Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 20 nmol 20 nmol


图片上传

图.稳定表达Cas9蛋白的HEK-293细胞,转染Alt-R™ crRNA(未标记):tracrRNA(标记),转染后48小时,荧光显微镜下10倍放大。 

 

 

7、电穿孔增强剂

Alt-R™ Cas9电穿孔Enhancer,是Cas9特异性的载体DNA,当使用原代细胞或难转染细胞时,可提高Lonza(原Amaxa)Nucleofector核转染系统等电穿孔设备对RNP的转染效率,进而提高基因编辑效率。

货号 产品名称 规格 备注
1075915 Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 2 nmol 2 nmol 电穿孔增强剂,增强转染效率
1075916 Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 10 nmol 10 nmol
10007805 Alt-R™ Cas9 Elec Enhancer, 100 nmol 100 nmol


 

 

8、HDR增强剂

Alt-R™ HDR Enhancer,小分子化合物,可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性,可用于Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶。

货号 产品名称 规格 备注
10007910 Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL 30 µL HDR增强剂,增加同源重组修复倾向性
10007921 Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL 150 µL
1081072 Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL 100 µL
1081073 Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL 500 µL


 

 

9、供体DNA(定制)

Alt-R™ HDR供体寡核苷酸,专门为同源重组修复基因敲入开发,具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率,可同时用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。

货号 产品名称 规格 备注
定制 Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol 2 nmol 45-200nt,Alt-R修饰和硫代磷酸酯PS修饰
定制 Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol 10 nmol
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg 3 µg 非常适合进行段基因组的修改和插入;带修饰双链DNA
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg 10 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg 3 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg 10 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg 3 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg 10 µg

 

 
 
 
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9实验流程

【方法一】
1、(使用IDT序列设计工具)设计Alt-R™ crRNA,使其间隔区(Spacer)序列与DNA靶序列互补,提交给IDT定制合成crRNA;
2、将Alt-R™ crRNA与Alt-R™ tracrRNA混合,通过crRNA的重复序列区(Repeats)与tracrRNA碱基配对, 形成向导RNA(guide RNA,简称gRNA);
3、将gRNA与Alt-R™ Cas9蛋白混匀,形成核糖核蛋白体(ribonucleoprotein,简称RNP);
4、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核;
5、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列,通过Cas9蛋白识别PAM序列(前间区序列邻近基序,protospacer adjacent motif,简称PAM),对DNA进行剪切;
6、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining,简称NHEJ),实现基因敲除(knockout);
②(使用IDT序列设计工具)设计供体DNA模板,进行同源重组修复(Homology directed repair,简称HDR),实现基因敲入(knockoin)、基因敲除、基因沉默等。












【方法二】
1、(用IDT工具)设计sgRNA,使其Spacer与DNA靶序列互补,提交给IDT定制合成sgRNA;
2、将sgRNA与Cas9蛋白混匀,形成RNP;
3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核;
4、通过sgRNA的Spacer识别DNA靶序列,通过Cas9蛋白识别PAM序列,对DNA进行剪切;
5、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复,实现基因敲除;
②(用IDT工具)设计供体DNA模板,进行同源重组修复,实现基因敲入、敲除、沉默等。












 

 
IDT Alt-R™ crRNA序列设计示意图


 

 

 

 
Alt-R™ CRISPR-Cas9优势

1、特别优化的crRNA/tracrRNA/sgRNA长度,提高基因编辑性能


以HPRT基因中的12个位点为靶点,分别使用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、Alt-R™ crRNA XT:tracrRNA、Alt-R™ sgRNA,与Alt-R™ Cas9核酸酶组装成3种RNP,加入2μM Alt-R™ Cas9电穿孔Enhancer,转染HEK-293细胞,培养48小时后,通过二代测序检测总的实验效率,结果显示其具有很好的稳定性。

 

 

2、化学修饰RNA,增加核酸酶抗性,减少免疫应答和细胞毒性

以HPRT1的12个位点为靶点,分别用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、体外转录(IVT)RNA,转染可高效表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK-293细胞,24小时后,测定常见应激反应基因IFIT1(A)和OAS2(B)的表达水平。(A)qPCR显示IVT RNA强烈诱导IFIT1,而Alt-R™ RNA无影响。(B)qPCR显示IVT RNA对OAS2的诱导可测,而Alt-R™ RNA处于基线。同时IFITM1、RIGI、OAS1等3个应激反应相关基因均得到相似结果,说明Alt-R™ RNA不会激活细胞先天免疫反应。


 

 

3、优化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白,提供更高的特异性切割

 

 
 
4、电穿孔增强剂,提高转染效率,尤其是原代细胞等较难转染的细胞

用0.125μM-4μM RNP(Alt-R™ crRNA:tracrRNA:Cas9复合体),通过Lonza Nucleofector 核转染K562细胞(A)、Jurkat细胞(B)、HEK-293细胞(C)时,使用电穿孔Enhancer(深蓝色)、不使用(浅蓝色)的效率。



 

 
5、HDR增强剂,提高同源重组修复效率
①提高多种细胞HDR

以人HPRT为靶点,使用Lonza Nucleofector核转染系统,将4μM RNP(由Alt-R™ crRNA、Alt-R™ tracrRNA、Alt-R™ Cas9组装),加入4μM Alt-R™ Cas9电穿孔Enhancer,以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作为同源重组修复DNA模板,转染人多种细胞系。电转后,细胞培养在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培养基中(绿色),或培养在含有DMSO的培养基中作为阴性对照(棕色),HEK-293、HeLa培养48小时,Jurkat、K562培养72小时,通过限制性片段长度多态性(RFLP)、靶序列PCR进行HDR分析,显示Alt-R™ HDR Enhancer可提高多种细胞类型的同源重组修复效率。



②提高多种基因HDR

以人基因组多个位点为靶点,将4μM Alt-R™ Cas9 RNP,加入4μM Alt-R™ Cas9电穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer单链DNA模板,通过电穿孔转染。电转后,细胞分别培养在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培养基(蓝色)、含有DMSO的培养基(绿色)、未处理的培养基(棕色),48-72小时后,通过RFLP、PCR进行HDR分析,显示Alt-R™ HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。


 

 

6、在线CRISPR序列设计工具,方便地设计高质量的crRNA/sgRNA/同源重组修复DNA模板/引物等

 

 

 

 
如物种的基因组富含A、T,或Alt-R™ CRISPR-Cas9的位点不适合,IDT同时提供CRISPR-Cas12a系统,尽可能满足实验需求。

Cas9和Cas12a系统区别和应用

 

 

 

 

 

IDT Alt-R™ CRISPR Alt-R™ CRISPR-Cas9系统 Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)系统
Alt-R™ Cas9核酸酶 Alt-R™ HiFi Cas9高保真核酸酶 Alt-R™ Cas9 D10A切口酶 Alt-R™ Cas9 H840A切口酶 Alt-R™ dCas9蛋白 Alt-R™ Cas12a核酸酶
特点 通用Cas9酶,易于使用且经济实惠 经序列优化的Cas9酶,提高中靶率,降低脱靶率,高性价比 突变的Cas9酶,在RuvC-like结构域中发生突变,使其缺失在非靶向链的切割能力 突变的Cas9酶,在HNH结构域中发生突变,使其缺失在靶向链的切割能力 突变的Cas9酶,仅结合靶向DNA,缺失核酸酶切割能力 通用Cas12a酶,富含AT的物种,或使用CRISPR-Cas9有限制
PAM识别 NGG TTTV或TTTN
DNA切割 双链 双链 靶向链 非靶向链 \ 双链
末端 平末端 5’突出 3’突出 \ 5’突出
建议用途 一般基因编辑实验 满足大多数CRISPR基因编辑需求,兼顾效率和成本 适用于同时使用2种crRNA,各自识别并切割2条链中一条,通过将spacer由20nt提高到40nt,实现更高特异性 基因沉默,CRISPR干扰CRISPRi 无法使用Cas9的基因编辑实验
规格 100 μg或500 μg
Cas9+gRNA crRNA 19-20nt特异性序列(推荐使用20nt),16nt通用序列 \
tracrRNA 67nt通用序列 \
Cas9+sgRNA sgRNA 19-20nt特异性序列(推荐使用20nt),80nt通用序列,经过序列修饰,不会引起细胞免疫反应,不会激活无关的基因 \
Cas12a+crRNA crRNA \ 20-24nt特异性序列(推荐使用21nt),20nt通用序列

 


注:
N=任意碱基
V=A、C、G
 

 

 

 

参考文献
 
1. Large-scale GMP-compliant CRISPR-Cas9–mediated deletion of the glucocorticoid receptor in multivirus-specific T cells. Rafet Basar,et al.,Blood Advances (2020) 4 (14): 3357–3367
2. Partner independent fusion gene detection by multiplexed CRISPR-Cas9 enrichment and long read nanopore sequencing.Christina Stangl,et al.,Nature Communications volume 11, Article number: 2861 (2020)
3. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Robin Graf,et al.,Cell Reports,Volume 26, Issue 5, 29 January 2019, Pages 1098-1103.e3
4. Rapid in vitro production of single-stranded DNA. Dionis Minev,et al.,Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 22, 16 December 2019, Pages 11956–11962
5. Neuron-Specific Genome Modification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats.Susanne Bäck,et al.,Neuron,Volume 102, Issue 1, 3 April 2019, Pages 105-119.e8
6. Highly Efficient Transgenesis in Ferrets Using CRISPR/Cas9-Mediated Homology-Independent Insertion at the ROSA26 Locus.Miao Yu,et al.,Scientific Reports volume 9, Article number: 1971 (2019) 
7. RNA‐guided endonuclease – in situ labelling (RGEN‐ISL): a fast CRISPR/Cas9‐based method to label genomic sequences in various species.Takayoshi Ishii,et al., New Phytol. 2019 May; 222(3): 1652–1661.
8. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Christopher A. Vakulskas,et al.,Naturemedicine,Published: 06 August 2018
9. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Eric J. Aird,et al.,Communications biology, Published: 31 May 2018


 

 

 

 
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