IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)基因编辑系统工具
——crRNA化学定制合成，重组Cas12a核酸酶
北京泽平代理的进口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）基因编辑系统，提供CRISPR-Cas12a（Cpf1）中crRNA（CRISPR-derived RNA）的化学合成定制服务，并生产商品化通用型重组Cas12a核酸酶（Cas12a nuclease，即Cpf1核酸酶，限制性内切酶，基因组DNA双链剪切）、以及增强RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白复合体）电转染效率的电穿孔增强剂、增强HDR（Homology directed repair，同源重组修复）概率的HDR增强剂、HDR供体DNA的化学合成服务，提供多重基因组编辑所需全套试剂的工具平台，为因物种基因组富含A、T、DNA靶点不合适而无法使用常规IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9系统，提供了更多选择。
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▲IDT Alt-R CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统（crRNA、Cas12（Cpf1）核酸酶、电穿孔增强剂、HDR增强剂、HDR DNA供体）
▲IDT Alt-R CRISPR-Cas9系统
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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）概述
IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统，对crRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对Cas12a（Cpf1）核酸酶结构域进行优化，获得了高保真的双链剪切功能，使用时仅需混合crRNA和Cas12a（Cpf1）核酸酶，再通过电穿孔（如Lonza Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。
传统构建CRISPR-Cas12a（Cpf1）质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas12a，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas12a（Cpf1）组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶率，进而提高了基因编辑效率。
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）产品
1、Cas12a（Cpf1）核酸酶
Alt-R™ Cas12a（Cpf1）核酸酶，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS），经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。V3酶和Ultra酶均可识别TTTV，而Ultra核酸酶增加了对TTTT的PAM（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif）识别。注：V=A、C、G
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
备注 |
| 1081068 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 100 µg |
100 µg |
识别TTTV位点，10 µg/µL，100 µg = 633 pmol |
| 1081069 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 500 µg |
500 µg |
| 10001272 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg |
100 µg |
识别TTTN位点，N表示A、T、C、G碱基 |
| 10001273 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg |
500 µg |
| 10007804 |
Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg |
5 mg |
| 10007922 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg |
100 µg |
识别TTTN位点，10 µg/µL，100 µg = 670 pmol |
| 10007923 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg |
500 µg |
| 10007924 |
Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg |
5 mg |
2、crRNA（定制）
Alt-R™ Cas12a crRNA，定制合成的crRNA，包含20-24nt的特异性序列（定制）和20nt的通用序列，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解。需要与Cas12a（Cpf1）核酸酶结合形成RNP复合体。
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
备注 |
| 定制 |
Alt-R™As Cas12a crRNA，2 nmol |
2 nmol |
40-45bp，与As.cas12a酶结合使用 |
| 定制 |
Alt-R™As Cas12a crRNA，10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 2 nmol |
2 nmol |
40-45bp，与L.b.cas12a酶结合使用 |
| 定制 |
Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 10 nmol |
10 nmol |
3、电穿孔增强剂
Alt-R™ Cas12a电穿孔Enhancer，是Cas12a特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞系时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备的对RNP的转染效率，进而提高实验效率。
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
备注 |
| 1076300 |
Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 2 nmol |
2 nmol |
电穿孔增强剂，增强转染效率 |
| 1076301 |
Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 10 nmol |
10 nmol |
4、HDR增强剂
Alt-R™ HDR Enhancer，小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas12a（Cpf1）核酸酶、Cas9核酸酶。
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
备注 |
| 10007910 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL |
30 µL |
HDR增强剂，增加同源重组修复倾向性 |
| 10007921 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL |
150 µL |
| 1081072 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL |
100 µL |
| 1081073 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL |
500 µL |
5、供体DNA（定制）
Alt-R™ HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率。
| 货号 |
产品名称 |
规格 |
备注 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol |
2 nmol |
45-200nt，Alt-R修饰和硫代磷酸酯PS修饰 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg |
3 µg |
非常适合进行段基因组的修改和插入；带修饰双链DNA |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg |
10 µg |
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）实验流程
1、设计crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；
2、将crRNA与Cas12a（Cpf1）核酸酶混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；
3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
4、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas12a蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；
5、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
IDT Alt-R™ crRNA序列设计示意图
Cas12a系统和Cas9系统区别和应用
| IDT Alt-R™ CRISPR |
Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9系统 |
| Alt-R™ Cas12a V3核酸酶 |
Alt-R™ Cas12a Ultra核酸酶 |
Alt-R™ Cas9核酸酶 |
Alt-R™ Cas9切口酶 |
| 特点 |
通用Cas12a酶，富含AT的物种，或使用CRISPR-Cas9有限制 |
经序列优化的Cas12a酶，比Cas12a通用型性能更佳 |
通用Cas9酶，易于使用且经济实惠 |
突变的Cas9酶，保留单链切割能力 |
| PAM识别 |
TTTV |
TTTN |
NGG |
| DNA切割 |
双链 |
双链 |
单链 |
| 末端 |
5’突出 |
平末端 |
5’突出/3‘突出 |
| 建议用途 |
无法使用Cas9的实验 |
需要高基因编辑效率的实验 |
一般实验 |
适用于同时使用2种crRNA，各自识别并切割2条链中一条，通过将spacer由20nt提高到40nt，实现更高特异性 |
| 规格 |
100 μg或500 μg |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
20-24nt特异性序列（推荐使用21nt），20nt通用序列 |
\ |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
\ |
19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），16nt通用序列 |
| tracrRNA |
\ |
67nt通用序列 |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
\ |
19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），80nt通用序列，经过序列修饰，不会引起细胞免疫反应，不会激活无关的基因 |
注：
N=任意碱基
V=A、C、G
参考文献
1.Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity. Stefano Stella,et al., Cell, Volume 175, Issue 7, 13 December 2018, Pages 1856-1871.e21
2. Switching the activity of Cas12a using guide RNA strand displacement circuits
. Lukas Oesinghaus & Friedrich C. Simmel, Nature Communications volume 10, Article number: 2092 (2019)
3. Sequence-Specific Recognition of HIV-1 DNA with Solid-State CRISPR-Cas12a-Assisted Nanopores (SCAN). Reza Nouri,et al., ACS Sens. 2020, 5, 5, 1273–1280
4. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Xiong Ding,et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4711 (2020)
5. Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Gavin J. Knott,et al., Nature Structural & Molecular Biology volume 26, pages315–321(2019)
6. Structural Basis for the Inhibition of CRISPR-Cas12a by Anti-CRISPR Proteins. HengZhang,et al.,Cell Host & Microbe, Volume 25, Issue 6, 12 June 2019, Pages 815-826.e4
7. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Isabel Strohkendl,et al., Molecular Cell,Volume 71, Issue 5, 6 September 2018, Pages 816-824.e3
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