NEB无缝克隆
——同源重组Gibson组装、Golden Gate 组装

 
北京泽平代理的美国进口NEB无缝克隆产品，提供基于同源重组Gibson组装（吉布森组装）的NEBuilder高保真无缝克隆试剂盒（含核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶），以及基于Golden Gate 组装（金门组装）的NEBridge无缝克隆试剂盒（BsaI-HFv2、BsmBI-v2）、50种IIS型限制性内切酶、T4 DNA连接酶等，支持≤52个片段的无缝组装，具备高组装效率、高灵活性，支持复杂DNA片段克隆，为生物实验分子克隆提供高性能的研究工具。




一、NEBuilder Gibson组装

NEBuilder无缝克隆技术，是对同源重组技术（即Gibson组装、吉布森组装）的升级，在待插入片段末端通过PCR扩增添加15~30bp重叠序列，在等温条件下，通过5'外切酶消化形成3'突出粘性末端，同源重组互补退火，高保真DNA聚合酶进行延伸，高保真DNA连接酶补平缺口，可实现≤11个片段的高效无缝组装，特别适合单链寡核苷酸ssOligo塔桥、文库构建、微型高通量克隆等应用。




 
NEBuilder拥有＞10年的开发应用经验，性能指标严格，保证数据实现，具备高组装效率、高保真度，即可解决复杂的高端克隆应用，也可节省常规克隆后续筛选时间。

1、不依赖内切酶——只需在多个片段末端添加重叠序列，仅质粒载体线性化时需要酶切，不受限制性内切酶所限，具备更大灵活性。

2、高组装效率——支持≤11个片段的无缝组装。

3、高保真度——使用高保真DNA聚合酶，即使5'末端、3'末端存在错配，高保真DNA聚合酶可在退火后切割去除错配序列（＜10nt），组装正确性高，无需反复筛选、测序。

4、兼容性强——支持＜100bp片段、＞10kb片段、低起始量组装，可使用合成的单链寡核苷酸ssOligo连接2条双链片段（如插入接头、gRNA文库）。

5、方便快速——只需15min、在同一管中即可完成无缝克隆。

6、设计工具——提供NEBuilder.neb.com 在线设计软件，可以方便、快捷地进行NEBuilder组装引物设计，以获得高效率、高正确性的无缝组装。

 

 
二、NEBridge Golden Gate 组装

用于无缝克隆的Golden Gate 组装技术（金门组装技术），在dsDNA片段两端通过PCR扩增添加IIS型限制性内切酶识别位点，经IIS内切酶酶切后，识别位点被移除，形成互补的4碱基突出末端，再使用T4 DNA 连接酶进行连接，可将多个DNA片段插入载体中， 实现两个片段、或多个片段的克隆，且克隆后无额外碱基的插入。

NEBridge Golden Gate 组装试剂，对传统技术进行升级，成功实现≤52个片段的高效组装，提供包括成品Golden Gate 试剂盒、50种IIS型限制性内切酶、连接酶预混液（添加了连接增强剂）、经典T4 DNA 连接酶等产品，帮助研究者快速构建重组质粒。


以IIS型限制性内切酶BsaI-HFv2为例，进行Golden Gate 组装时，需要在dsDNA片段的两端加上其识别位点（GGTCTC）。酶切后，识别位点被移除，组装片段末端带有设计好的特定4碱基突出以指导组装。


1、高组装效率——支持≤52个片段的高效组装，具备非常高的组装效率和组装准确率，其中＜30个片段的组装效果更佳。


对于包含12、24、35、52个片段的Golden Gate 组装反应，显示了含有正确组装的菌落百分比。误差线为至少3个重复的标准差。以下几篇文献对此进行了报道：

1. Pryor, J.M., et al. (2022) ACS Synth. Biol. e0525
2. Pryor, J. M. et al. (2020). PLoS One, e8592
3. Potapov, V. et al. (2018). ACS Synth. Biol., e0333 

 
2、丰富IIS型内切酶——NEB提供业内更多的50种IIS型限制性内切酶，其中9种酶经过Golden Gate 组装验证，提供了更多酶切位点选择。
 

 
3、高兼容性——支持高GC含量、高重复序列、＜100bp片段、＞15kb片段的复杂组装。

4、高保真度——NEB经典T4连接酶，通过高保真末端连接，提高复杂多片段组装的正确性（20个片段组装正确率＞90%）；升级的NEBridge连接酶预混液，对缓冲液体系、操作步骤进行优化，搭配NEB IIS型内切酶使用，可进一步提高连接效率和保真度。


图. 使用NEBridge连接酶预混液进行24个片段的Golden Gate 组装。使用NEBridge连接酶预混液时，每微克载体DNA产生2.2±0.2*10⁶个正确组装的菌落，保真度为94.3±1%，而使用NEB T4 DNA 连接酶缓冲液时，每微克载体DNA产生8.3±2.1*10⁵个正确组装的菌落，保真度为69.8±10.7%。


5、使用灵活——提供Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HFv2、BsmBI-v2）、50种IIS型限制性内切酶、NEBridge连接酶预混液、T4 DNA 连接酶等丰富产品形式，供实验人员灵活使用。

6、操作简单——酶切和连接反应可在同一管中完成，简化实验步骤。

7、设计工具——提供GoldenGate.neb.com 在线设计软件，可以方便、快捷地进行Golden Gate 组装引物设计，通过预测、评估粘性末端链接偏好，实现复杂片段的高保真组装。

 
 

DNA组装选择

 

 
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